紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥中心（MSKCC）和GRAIL聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)，今天帶來(lái)一項(xiàng)重要研究成果。

這項(xiàng)由MSKCC實(shí)驗(yàn)病理學(xué)主任JorgeReis-Filho和臨床醫(yī)學(xué)科學(xué)家Pedram Razavi共同領(lǐng)導(dǎo)的研究，對(duì)124例癌癥患者的cfDNA、腫瘤組織樣本和白細(xì)胞DNA，以及47名無(wú)癌志愿者的cfDNA和白細(xì)胞DNA，進(jìn)行了超高深度測(cè)序（60000×）。

他們發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者血液cfDNA中攜帶的大部分基因突變，可能不是來(lái)自于癌細(xì)胞，而是血液中白細(xì)胞。

具體說(shuō)來(lái)，在癌癥患者的cfDNA中，克隆性造血帶來(lái)的變異可能占53.2%；而在健康的志愿者體cfDNA中，這一數(shù)字能達(dá)到81.6%。這意味著，克隆造血帶來(lái)的突變比科學(xué)家原來(lái)認(rèn)為的要常見(jiàn)的多。

“看到這個(gè)結(jié)果，我們差點(diǎn)兒從椅子上掉下去?！?/span>Reis-Filho說(shuō)[1]。

這也給液體活檢相關(guān)的研究提出了挑戰(zhàn)，在給患者開(kāi)展液體活檢時(shí)，白細(xì)胞DNA應(yīng)該是必檢項(xiàng)目，甚至需要開(kāi)展超高深度的測(cè)序。

Pedram Razavi、DavidN. Brown和華人科學(xué)家Bob T. Li是共同第一作者。研究論文發(fā)表在頂級(jí)期刊《自然·醫(yī)學(xué)》上[2]。

▲ 從左到右：Pedram Razavi，Jorge Reis-Filho，Bob Li（圖源：MSKCC）

我們都知道，隨著人體各種細(xì)胞的死亡破裂，細(xì)胞的DNA會(huì)釋放到血液中，這些DNA就構(gòu)成循環(huán)游離DNA（cfDNA）。同理，腫瘤細(xì)胞也會(huì)死亡，并往血液中釋放游離DNA，這就是我們所熟悉的循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）[3，4]。很顯然，ctDNA只是cfDNA中帶有基因變異的那一小部分[5-7]。

ctDNA的發(fā)現(xiàn)，讓科學(xué)家對(duì)癌癥的液體活檢技術(shù)寄予厚望。

雖然科學(xué)家想到了很多方法研究ctDNA[8-10]，但是仍難擺脫多種混雜因素的影響[11]。

其中影響比較大的一個(gè)是克隆性造血。

克隆性造血是那些有基因突變的造血干細(xì)胞，通過(guò)多系造血分化，形成攜帶同樣突變的終末分化成熟血細(xì)胞[12]。雖然其中一些突變會(huì)導(dǎo)致后代血細(xì)胞具備適應(yīng)性優(yōu)勢(shì)，出現(xiàn)不成比例的擴(kuò)增[13]，但是這種克隆性擴(kuò)增并不是惡性的。

克隆性造血會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而增加，之前有研究表明31%的老年人都會(huì)出現(xiàn)克隆性造血[14]。而且，導(dǎo)致克隆性造血的基因突變，也可以通過(guò)cfDNA檢測(cè)到[15]。

Reis-Filho等認(rèn)為，克隆性造血肯定會(huì)影響腫瘤學(xué)家對(duì)cfDNA測(cè)序結(jié)果的解釋，尤其是很大一部分cfDNA片段源自造血細(xì)胞[16]。

▲ 圖片來(lái)自pixabay.com

盡管大量的研究表明，通過(guò)cfDNA檢測(cè)到的基因突變，與通過(guò)腫瘤組織檢測(cè)到的基因突變有很好的一致性[10]。不過(guò)，還是有科學(xué)家在cfDNA中發(fā)現(xiàn)了很多腫瘤組織中不存在的基因突變[6]。當(dāng)然啦，這部分突變有可能是因?yàn)榻M織活檢取樣的不全面帶來(lái)的，也有可能是克隆性造血導(dǎo)致的。

關(guān)于這個(gè)問(wèn)題，Reis-Filho等認(rèn)為需要好好研究一番。

在2015年9月到2016年8月之間，研究人員一共招募了124名晚期未經(jīng)治療或者進(jìn)行性轉(zhuǎn)移的癌癥患者，其中乳腺癌（MBC）患者39名，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者41名，前列腺癌（CRPC）患者44名。另外還招募了50名沒(méi)有癌癥的志愿者，作為對(duì)照樣本，不過(guò)最終只有47名無(wú)癌志愿者的樣本有評(píng)估價(jià)值。

研究人員從癌癥患者身上獲取了腫瘤組織樣本、cfDNA和白細(xì)胞DNA，從無(wú)癌志愿者身上獲取了cfDNA和白細(xì)胞DNA樣本。

獲取樣本之后，他們基于已經(jīng)獲得FDA批準(zhǔn)的MSK-IMPACT平臺(tái)，給每個(gè)樣本獨(dú)立開(kāi)展了深度高達(dá)60000×的測(cè)序（這個(gè)測(cè)序深度，成本該有多高……）。

▲ 實(shí)驗(yàn)流程圖

從總體上看，基于腫瘤組織的活檢發(fā)現(xiàn)了740個(gè)突變，基于cfDNA的檢測(cè)包含其中的530（71.6%）。具體到各個(gè)癌種的話，比例也是類似的，乳腺癌72%，非小細(xì)胞肺癌和前列腺癌是71%。

而且，在cfDNA發(fā)現(xiàn)的基因突變中，有一些突變雖然在腫瘤組織檢測(cè)中出現(xiàn)，但是頻率極低，還有一些在腫瘤組織和白細(xì)胞中均沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)（研究人員把它們叫做VUSOs）。

在確定了他們這個(gè)高深度測(cè)序方法的準(zhǔn)確性和敏感性之后。研究人員推測(cè)，那些在腫瘤組織和白細(xì)胞中均沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)突變，可能反應(yīng)了腫瘤的進(jìn)化和異質(zhì)性。而攜帶這部分變異的腫瘤組織，可能沒(méi)有被活檢采集到。

通過(guò)以上數(shù)據(jù)，我們不難發(fā)現(xiàn)，cfDNA檢測(cè)和基于組織的活檢還是存在一定的差異的。

▲ cfDNA檢測(cè)的主要基因突變分析

緊接著，研究人員又開(kāi)展了一項(xiàng)探索性分析：是否可以通過(guò)cfDNA評(píng)估TMB、腫瘤突變特征和MSI。

分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織活檢發(fā)現(xiàn)了6個(gè)高TMB的樣本，其中4例樣本也被cfDNA判定為有高TMB。不過(guò)，cfDNA還判定另外6個(gè)樣本為高TMB樣本，但是腫瘤組織檢測(cè)結(jié)果不支持cfDNA的結(jié)果。

在cfDNA確定的10個(gè)高TMB樣本中，有75%的突變是在腫瘤組織中出現(xiàn)頻率低，以及在腫瘤組織和白細(xì)胞中均沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)的。據(jù)此，研究人員進(jìn)一步推測(cè)，這可能確實(shí)是腫瘤的空間異質(zhì)性導(dǎo)致的，它們只在一些部位出現(xiàn)超突變，而這個(gè)部位恰恰沒(méi)有被組織活檢取到樣。隨后的基因分析也從側(cè)面佐證了上述結(jié)果。

總結(jié)以上數(shù)據(jù)，研究人員認(rèn)為，cfDNA測(cè)序可以準(zhǔn)確檢測(cè)整個(gè)腫瘤基因組中很大一部分的突變，或許可以反映患者腫瘤的TMB、腫瘤突變特征和MSI。而且，cfDNA可以檢測(cè)到腫瘤組織活檢發(fā)現(xiàn)不了的亞克隆突變。

▲ TMB分布圖

隨后，研究人員又分析了cfDNA檢測(cè)到的突變生物學(xué)來(lái)源。在無(wú)癌的志愿者樣本中，cfDNA檢測(cè)到的突變（364），有81.6%（297）出現(xiàn)在了白細(xì)胞DNA中；而在癌癥患者群體中，cfDNA檢測(cè)到的1727個(gè)突變，有53.2%（918）出現(xiàn)在了白細(xì)胞DNA中。

并且通過(guò)一系列的分析，研究人員認(rèn)為，通過(guò)cfDNA進(jìn)行超高深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)的基因突變，不太可能是技術(shù)本身帶來(lái)的假陽(yáng)性。而且，之前研究中開(kāi)展的的白細(xì)胞DNA低深度測(cè)序[14，17-20]，可能大大低估了克隆性造血的普遍程度。

總之，在Reis-Filho團(tuán)隊(duì)看來(lái)，他們提出的這種超高深度cfDNA測(cè)序分析，確定克隆性造血突變是cfDNA中非腫瘤突變的最可能來(lái)源。而且這個(gè)比例相當(dāng)驚人，至少在這個(gè)研究中，93.6%的無(wú)癌志愿者的白細(xì)胞攜帶一個(gè)克隆性造血突變，而這一比例在癌癥患者群體中竟高達(dá)99.1%。

▲ 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程圖

最后，論文作者在文章的討論部分指出了一個(gè)有趣的現(xiàn)象。他們認(rèn)為，當(dāng)前大多數(shù)臨床的cfDNA檢測(cè)，都沒(méi)有同時(shí)檢測(cè)白細(xì)胞的DNA。結(jié)合著這個(gè)研究成果來(lái)看，這種不同時(shí)檢測(cè)白細(xì)胞DNA的做法，肯定是不合適的。

不過(guò)，我今天特地了解了幾個(gè)國(guó)內(nèi)頭部腫瘤測(cè)序公司的情況，基本都在檢測(cè)cfDNA的同時(shí)，檢測(cè)了白細(xì)胞的DNA，只是測(cè)序深度遠(yuǎn)低于MSKCC這個(gè)研究。

無(wú)論如何，這個(gè)研究一方面證明了cfDNA檢測(cè)相較于組織活檢的優(yōu)點(diǎn)，另一方面也警示相關(guān)研究人員，在檢測(cè)cfDNA的同時(shí)，一定要檢測(cè)白細(xì)胞的DNA，最好是超高深度測(cè)序。

參考資料：

[1].https://www.mskcc.org/blog/many-mutations-detected-liquid-biopsy-tests-do-not-come-cancer-cells-msk-study-finds

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